氨基酸衍生物的合成，尤其是结构多样的官能化氨基酸构筑单元的构建，仍是现代合成化学中的核心难题。近日，江南大学周志教授在知名期刊Organic Letters上发表了题为“Artificial Enzyme Design with an Abiological Salicylaldehyde Site Enables Biocatalytic Activation of Glycine Esters”的研究论文。本文报道通过将非天然水杨醛（SA）结构单元共价接入肌红蛋白骨架，构建了带有仿生磷酸吡哆醛（PLP）类催化中心的人工酶。该工程化催化剂模拟PLP依赖型酶所采用的底物活化策略，促进高活性甘氨酸酯亲核试剂生成，实现了碳-碳键形成反应中的直接α位官能化。该研究构建了一个用于合成氨基酸衍生物的生物催化平台，证明了将水杨醛非天然催化中心整合到蛋白质中，可以实现经典PLP依赖性酶无法催化的新型转化反应。

功能化氨基酸砌块是药物合成不可或缺的结构单元。PLP依赖酶是自然界中功能最丰富的生物催化剂家族之一，能够在氨基酸的α、β、γ位实现多样的C-C键构建反应，被广泛用于非经典氨基酸、杂环骨架的合成。这类酶依靠席夫碱中间体完成催化，PLP作为“电子阱”稳定碳负离子中间体，实现各类成键转化。但天然PLP酶存在固有短板：底物范围大多局限于天然氨基酸及其类似物；依赖醌式中间体的催化机制，很难拓展到非天然亲电试剂与全新反应模式。小分子醛催化可实现甘氨酸衍生物的不对称官能化，却难以嵌入酶体系。本研究通过位点特异性共价连接含水杨醛辅因子，在肌红蛋白支架中成功构建类PLP的醛活性中心，设计得到一种全新的人工酶。该人工酶通过亚胺活化策略，可直接催化甘氨酸酯衍生物与α,β-不饱和酮发生C-C键形成反应。这项工作证明，人工酶可以突破天然生物催化剂的固有限制，实现传统PLP依赖酶无法覆盖的新型催化反应，为开发非天然羰基生物催化、合成多样化氨基酸砌块提供了全新策略。

基于课题组之前的肌红蛋白骨架，选取活性口袋内11个氨基酸残基，逐一突变为半胱氨酸，用于定点连接水杨醛辅因子，探究了辅因子在蛋白口袋中的空间位置对催化活性的影响。高分辨质谱HRMS证实，SA成功共价连接到MYO_Cys，完成人工酶文库构建。

本研究选取甘氨酸酯与α,β-不饱和酮的C-C键生成反应作为模型反应，对人工酶文库开展催化筛选。所有突变体均可以检测到目标产物，产率介于14%~36%，证明共价接入的SA能够在蛋白微环境中活化甘氨酸酯，验证了该人工酶催化策略的可行性。该反应虽未观测到对映选择性，但表现出中等非对映选择性（dr=3.4:1），可能是当前活性口袋对底物束缚能力、立体化学调控能力尚有不足。其中MYO_V68C_SA催化性能最优，产物产率可达36%，被选定为后续条件优化的基础骨架。

以MYO_V68C_SA为核心催化剂，团队系统完成反应条件优化，考察pH、有机溶剂、催化剂用量、底物比例、反应时间等参数。在最优条件下，目标产物产率提升至58%，在温和水相体系下实现醛介导的甘氨酸酯活化与C-C键构建。在此基础上，研究拓展底物适用范围，测试了一系列带有芳香、杂芳香取代基的α,β-不饱和酮。芳环取代基的电子效应与位阻效应会影响底物在工程化活性口袋中的定位与活化；苯基取代底物效果最优，产率可达68%；萘环、噻吩杂环等较大骨架也能够兼容，展现出不错的底物耐受性。

本研究构建了带有非天然水杨醛催化位点、类PLP结构的肌红蛋白人工酶，实现无保护甘氨酸衍生物的直接官能化。不同于经典PLP依赖酶，该体系依靠醛基活化甘氨酸酯，无需PLP稳定的醌式中间体，即可完成与烯酮的C-C键形成。研究将仿生有机催化与蛋白骨架相结合，突破天然氨基酸依赖生物催化的反应边界，为蛋白新催化功能的设计开发提供了新策略。

这一成果近期发表在Organic Letters上，江南大学周志教授为论文通讯作者，江南大学博士生盛玉辉为论文第一作者。工作得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金等项目的支持。

文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.orglett.6c03443

周志教授课题组主页：https://www.x-mol.com/groups/zhouzhi

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